CRISPR/Cas12a新系统（HEPSD平台）实现单核苷酸变异精准检测！

2025年4月，湖南师范大学杨荣华教授和邹振副教授团队在《Nucleic Acids Research》（IF=16.7）上发表了一篇题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”的文章。

 

文章开发了一种基于CRISPR/Cas12a的SNV检测平台——HEPSD(high-energetic-penalty SNV detection platform)，该系统采用二元crRNA结构设计，能够激活Cas12a的切割活性，同时通过非平衡杂交驱动调节放大单核苷酸错配信号。此外，HEPSD在极端GC含量下对难以检测的SNV（包括摆动突变）具有很好的区分效果，对临床样本区分的准确度也与qPCR和二代测序（NGS）具有高度一致性，准确率高为 100% 。该平台的有效性证明了其在临床分子诊断方面的潜力，其设计原理还可拓展至其他CRISPR系统。

 

研究背景

 

单核苷酸位点变异 (SNVs)是常见的遗传变异形式，与多种严重疾病（如癌症、单基因疾病和传染病）的发生密切相关。传统的SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标、ARMS-PCR等），并不能适用于难检测的 SNV (如摆动碱基对和高 GC 含量区域的SNV)。 

CRISPR-Cas系统（如Cas12a）在核酸检测领域具有革命性意义，但Cas12a在crRNA介导的识别过程中无法保证对所有单碱基错配的高特异性。尽管通过优化Cas蛋白、设计crRNA等策略提高了Cas12a的性能，但其特异性增强的机制尚不完全清楚，且对摆动碱基对或高GC含量区域的SNV检测仍具挑战性。

 

研究结果

 

1. RNA/DNA 二元探针与热力学分析

二元探针 (BPs) 由两个杂交臂组成：一个长臂和一个短臂，专门设计用于通过选择性杂交来区分 SNVs。研究人员比较了线性探针 (LPs) 和二元探针 (BPs)，结果显示BPs 在更广泛 (△T> 40℃) 和更低的温度范围内工作。此外，使用圆二色光谱分析了 LPs 和 BPs 与突变的杂交状态，发现靶向不匹配序列的 BPs 在广泛的温度范围内保持长时间的结合状态。进一步的系统评估证明BPs 在常规 37°C 下保持最佳活性。

 

2. 非平衡杂交驱动的高能量 SNV 检测系统

之后，研究人员基于 BP 辅助Cas12a 系统的激活性能，设计了二元CRISPR RNA（crRNA）结构，并结合Cas12a 系统开发了HEPSD平台。分子动力学模拟（MD）和荧光各向异性（FA）分析表明，HEPSD在匹配目标中形成稳定的三元复合物，而在错配目标中表现出动态不稳定性，从而有效抑制Cas12a的激活。2-氨基嘌呤（2-AP）荧光实验证实，HEPSD在错配情况下仅部分解旋DNA，避免了Cas12a的误激活。总的来说，与传统的 CRISPR / Cas12a 系统相比，HEPSD平台利用非平衡杂交驱动的调控机制，显著放大了单核苷酸错配的吉布斯自由能的变化、提高了SNV识别的选择性（图1）。

图1  HEPSD和传统CRISPR/Cas12a系统的比较

 

3. HEPSD对难检测SNV的高效区分能力

在开发了HEPSD并阐明了其工作机制后，随后对其对SNV的检测性能进行了评估。HEPSD能够区分传统方法难以检测的SNV，包括高GC含量区域的突变和形成摆动碱基对的错配（如rG-dT）。在低GC（30%）和高GC（70%）背景下，HEPSD对PAM近端和远端区域的错配均表现出高特异性，检测限低至0.01%突变等位基因频率（VAF）。凝胶电泳（PAGE）和实时荧光实验显示，HEPSD对完全匹配的目标保持高效切割活性，而对错配目标几乎无活性。

 

4. HEPSD分析BRAF V600E和EGFR L858R突变

研究人员为了进一步评估优化后的SNV检测方法（HEPSD）对临床相关癌症突变的有效性，选择BRAF V600E和EGFR L858R作为靶突变。结果显示，在104例BRAF V600E和28例EGFR L858R临床样本（包括组织和血浆）中，HEPSD的敏感性和特异性均达到100%，与定量PCR（qPCR）和下一代测序（NGS）结果高度一致。在血浆样本中，结合阻断置换扩增（BDA）技术，HEPSD成功检测到低丰度突变（VAF低至0.01%），优于传统qPCR方法。ROC曲线分析显示，HEPSD的AUC值为1.000，表明其卓越的诊断准确性。（图2）

 

 

图2  BRAF V600E的HEPSD敏感性和特异性评估（n=104）

 

结论与展望

 

本文介绍了一种二元间隔物辅助的CRISPR/Cas12a平台（HEPSD平台），通过创新设计“二元crRNA架构”，引入非平衡杂交驱动调控，显著放大了错配碱基的能罚差异，从而实现了超高特异性识别。

HEPSD 平台在处理难以检测的SNV方面具有卓越的表现，如能精准区分传统方法难以检测的错配类型(如”摇摆碱基”)，在GC含量高达70%的复杂区域依然保持优异性能，并且可识别靶区内任意位置的突变。而在对 132 个临床样本的研究中，HEPSD 平台也成功地检测和鉴定了 BRAF V600E 或 EGFR L858R 变体，准确率为 100%，这表明其在临床分子诊断中具有巨大的潜力。

总的来说，HEPSD平台实现了对SNV的高灵敏、高特异性检测，尤其在难检测突变和临床样本中表现优异。HEPSD平台不仅为癌症早诊、个性化治疗提供了新工具，其设计原理还可拓展至其他CRISPR系统，未来或助力基因编辑的脱靶控制！  

 

 

 

该研究中所有DNA和RNA寡核苷酸的合成与纯化均由河马生物提供。

 

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参考文献

[1] Liu Q, Jiang Z, Li S, Li Y, Wan Y, Hu Z, Ma S, Zou Z, Yang R. Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants. Nucleic Acids Res. 2025 Apr 10;53(7):gkaf287. doi: 10.1093/nar/gkaf287. 

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